隨著輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的不孕不育夫婦通過(guò)行體外受精－胚胎移植（IVF-ET）成功孕育下一代。作為丈夫取出優(yōu)質(zhì)的精子很重要，然而，在接受輔助生殖技術(shù)助孕的患者中，一些患者由于精神壓力、心理因素、取精環(huán)境等各種原因?qū)е氯【　Ｈ【⒅苯訉?dǎo)致取卵移植手術(shù)取消。本研究對(duì)IVF-ET過(guò)程中可能出現(xiàn)取精困難的患者在取卵前提前進(jìn)行精液冷凍，并與取卵當(dāng)天成功取出新鮮精液的患者的胚胎情況進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)提前冷凍精液在取精困難患者中的可行性及對(duì)妊娠結(jié)局的影響。

資料與方法

１．１一般資料：

回顧性分析2018年１月至2019年１２月進(jìn)入體外受精（IVF）周期取精困難男性患者７０例及其配偶。男方納入標(biāo)準(zhǔn)：１）既往有取精困難史或取精失敗者；２）取卵日前曾順利取過(guò)精液，且有精子；３）無(wú)不射精病史或逆行射精；４）卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、催乳激素（PRL）、雌激素（E）、雄激素（T）正常。

夫婦雙方均自愿簽署知情同意書(shū)并且男方均提前冷凍精液。女方納入標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)規(guī)律正常，子宮卵巢形態(tài)正常，促排方案均采用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRH-a）超長(zhǎng)方案。其中男、女方年齡分別為（34.73±5.48）歲和（31.91±3.44）歲，不孕年限（3.31±1.83）年，女方BMI（21.57±1.83）ｋｇ／ｍ２。

70例中取卵日重新獲取新鮮精液40例（新鮮組），取卵日取精失敗使用冷凍精液30例（冷凍組）。兩組間的年齡、不孕年限、女方ＢＭＩ、移植胚胎數(shù)、平均獲卵數(shù)等基本資料對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＞0.05，表１）。

１．２方法：

１．２．１ＧｎＲＨ－ａ超長(zhǎng)方案：女方于月經(jīng)周期第２～５天肌內(nèi)注射或皮下注射長(zhǎng)效藥物進(jìn)行降調(diào)節(jié)。Ｂ超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，卵泡≥18ｍｍ時(shí)，肌注人絨毛膜促性腺激素（HCG）10000Ｕ。注射后３６ｈ行Ｂ超引導(dǎo)經(jīng)陰道取卵術(shù)。

１．２．２精液冷凍、解凍及優(yōu)化處理：按照《ＷＨＯ人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第５版，利用超低溫冷凍技術(shù)冷凍精液。冷凍方法為液氮熏蒸法：室溫下操作，用一次性無(wú)菌吸管按照等體積加入精子冷凍液，逐滴加入；邊加邊輕柔搖晃取精杯，使之充分混勻；加完后，準(zhǔn)備好精子冷凍管，一般為1.8ｍＬ／管，加入精液和精子冷凍液的混合液體，于液氮面上熏蒸，最后投入液氮罐。解凍方法：37℃水浴箱20ｍｉｎ；涂片顯微鏡檢查；根據(jù)解凍后的精液濃度及前向活動(dòng)率行IVF，解凍后濃度活力不足IVF的，需行卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（ICSI）助孕治療。IVF精液優(yōu)化處理為梯度離心加上游法。

１．３觀察指標(biāo)：

１）囊胚評(píng)分：16-20ｈ后觀察精卵結(jié)合情況，正常受精后進(jìn)行卵裂期胚胎和囊胚期的囊胚評(píng)分，具體的胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照《人類(lèi)體外受精胚胎移植實(shí)驗(yàn)室操作專家共識(shí)（2016）》。正常受精率＝雙原核（２PN）受精數(shù)／獲卵數(shù)×100％。卵裂率＝受精卵裂數(shù)／雙原核受精數(shù)×100％。優(yōu)質(zhì)胚胎率＝優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)／雙原核受精卵裂數(shù)×100％。囊胚形成率＝形成囊胚數(shù)／囊胚培養(yǎng)數(shù)×100％。

２）臨床妊娠：移植14ｄ后，查血HCG確認(rèn)妊娠；第３５天Ｂ超，可見(jiàn)到孕囊及心管搏動(dòng)確定為臨床妊娠。妊娠率＝妊娠周期數(shù)／移植周期數(shù)×100％。

１．４統(tǒng)計(jì)方法：

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。年齡、不孕年限、女方ＢＭＩ、移植胚胎數(shù)、平均獲卵數(shù)采用ｘ±ｓ表示，兩組間比較采用兩樣本ｔ檢驗(yàn)；正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率和臨床妊娠率采用χ２檢驗(yàn)。Ｐ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

兩組間的正常受精率、卵裂率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＞0.05），見(jiàn)表２。

討論

在接受輔助生殖技術(shù)過(guò)程中，取精困難是不可避免的意外情況。針對(duì)取精困難，干預(yù)措施較多，比如睪丸或附睪穿刺取精、卵子玻璃化冷凍技術(shù)。通過(guò)睪丸或附睪取出的精子量少，不足以IVF，必須改行ICSI，這樣不僅會(huì)改變患者的授精方式，而且與常規(guī)IVF相比，ICSI是否能夠提高胚胎質(zhì)量，是否能夠獲得更好的臨床結(jié)局尚無(wú)定論。

有研究認(rèn)為ICSI既不能改善胚胎質(zhì)量，也不能改善臨床結(jié)局，并且ICSI可能存在安全隱患，會(huì)對(duì)胚胎造成負(fù)面影響。同時(shí)，進(jìn)行ICSI技術(shù)所需要的精力和費(fèi)用也更多。盡管?chē)?guó)內(nèi)有研究表明，卵子玻璃化冷凍技術(shù)在輔助生殖中具有較好效果，有助于保存女性生育能力；但是由于卵子細(xì)胞大、體表面積與體積比小、含水分多、卵子的紡錘體及其他細(xì)胞器對(duì)溫度敏感等因素，使得這項(xiàng)技術(shù)難以普及。

目前精子冷凍技術(shù)比較成熟，患者容易接受，因此本中心把提前冷凍精液作為優(yōu)先采取的措施。患者提前冷凍精液時(shí)，取精環(huán)境更加安靜，取精時(shí)間更加充裕，因此患者成功取出精液的概率更高。不少患者就因?yàn)橛辛恕皟鼍弊鳛楸５椎男睦戆凳荆谂饺÷讶枕樌〕鼍骸５牵瑢?duì)于冷凍精子是否會(huì)對(duì)胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局造成影響，一直是臨床最為關(guān)心的問(wèn)題。本文結(jié)果顯示，兩組間的正常受精率、卵裂率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明精液冷凍可能不會(huì)影響胚胎的質(zhì)量，并且不會(huì)影響妊娠結(jié)局。

這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。這主要是因?yàn)椋诰豪鋬鲞^(guò)程中，精子通過(guò)精液冷凍液的脫水作用能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的水分幾乎完全置換到細(xì)胞外，細(xì)胞在－196℃的液氮中冷凍時(shí)，剩余的水分不易造成大冰晶，所以不會(huì)損傷精子的微絲微管；精子在復(fù)蘇后，完整的精子可以順利完成精卵結(jié)合。有研究報(bào)道，冷凍精子復(fù)蘇后會(huì)增加精子的ＤＮＡ損傷，影響精子的ＤＮＡ碎片率。精子ＤＮＡ碎片率升高，正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率和妊娠率會(huì)降低。

但是，卵子和胚胎對(duì)ＤＮＡ具有一定的修復(fù)能力，其中胚胎對(duì)精子ＤＮＡ損傷修復(fù)能力的大小與母系基因的完整性和卵子的質(zhì)量密切相關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為，對(duì)于精子ＤＮＡ碎片率較高以及嚴(yán)重少、弱、畸形精子癥的標(biāo)本，采用密度梯度離心法能夠收集形態(tài)正常和活力較好的精子。本文中冷凍組和新鮮組的精液均采用密度梯度離心加上游法處理，處理后濃度及活力均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，預(yù)知取卵日可能會(huì)取精失敗的患者可提前冷凍精液，這種辦法是可行的，并且不會(huì)影響胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局。當(dāng)然，體外受精－胚胎移植治療中，應(yīng)做好足夠的應(yīng)對(duì)措施，盡量避免因取卵日男方無(wú)法提供足夠精子而選擇卵子冷凍。